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熒光素標(biāo)記需要符合哪些要求?

更新時(shí)間:2023-06-09  |  點(diǎn)擊率:641
  常用熒光素標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法有攪拌法和透析法兩種。以FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記為例,攪拌標(biāo)記法為:先將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液用0.5ml/L pH9.0的碳酸鹽緩沖液平衡,隨后在磁力攪拌下逐滴加入FITC溶液,在室溫持續(xù)攪拌4~6h后,離心,上清即為標(biāo)記物。此法適用于標(biāo)記體積較大,蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記時(shí)間短,熒光素用量少。但本法的影響因素多,若操作不當(dāng)會引起較強(qiáng)的非特異性熒光染色。
  透析法適用于標(biāo)記樣品量少,蛋白含量低的抗體溶液。此法標(biāo)記比較均勻,非特異染色也較低。方法為:先將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中,置于含F(xiàn)ITC (異硫氰酸熒光素)的0.01mol/L pH9.4碳酸鹽緩沖液中反應(yīng)過夜,以后再對PBS透析法去除游離色素。低速離心,取上清。
  熒光素標(biāo)記完成后,還應(yīng)對標(biāo)記抗體進(jìn)一步純化以去除未結(jié)合的游離熒光素和過多結(jié)合熒光素的抗體。純化方法可采用透析法或?qū)游龇蛛x法。
  用于熒光素標(biāo)記的抗體,要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應(yīng)含有針對標(biāo)本中正常組織的抗體。一般需經(jīng)純化提取IgG后再作標(biāo)記。作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求:
 ?、賾?yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán),與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離,而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。
 ?、跓晒庑矢?,與蛋白質(zhì)結(jié)合后,仍能保持較高的熒光效率。
 ?、蹮晒馍珴膳c背景組織的色澤對比鮮明。
 ?、芘c蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。
 ?、輼?biāo)記方法簡單、安全無毒。
  ⑥與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定,易于保存。
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